کارایی واکسن‌های تجاری در مقابله با ویروس H5N8 در مصر

چکیده

ویروس فوق حاد پرندگان H5N8 کِلِید 2.3.4.4 در پرندگان وحشی و اهلی، زمستان سال‌های 2017-2016 در مصر شناسایی شد و واکسیناسیون براساس واکسن‌های تجاری H5 به عنوان یک راهبرد کنترلی اساسی در طیور مصر مورد استفاده قرار گرفت. در این مطالعه، کارایی 8 نوع از «معمول‌ترین واکسن‌های H5 موجود در بازار مصر» با یک «واکسن تجربی ساخته شده از ویروس با حدت کم آنفلوانزای پرندگان H5N8 در حال گردش در این کشور» که از طریق ژنتیک معکوس تهیه شده، مقایسه شده است. نتایج نشان داد، 2 واکسن تجربی و واکسن تجاری Re-5 قادر بودند به صورت کامل از جوجه‌ها محافظت کرده و به شکل قابل توجهی دفع ویروس را کاهش دهند. نتایج همچنین نشان داد بیشتر واکسن‌های تجاری مورد بررسی در این مطالعه، «ناکارآمد» بودند؛ چراکه بذر ویروس‌های موجود در این واکسن‌ها از نظر ژنتیکی از ویروس‌های H5N8رایج در حال گردش در مصر متمایز هستند. البته برخی از واکسن‌های تجاری، جوجه‌ها را در مقابل تلفات محافظت می‌کنند، اما در جلوگیری از دفع ویروس بی‌اثرند. بنابراین، بروزرسانی و تقویت راهبرد کنترل و جلوگیری از H5N8 در مصر توصیه می‌شود و لازم است راهبرد واکسیناسیون براساس ویروس در گردش رایج در کشور در نظر گرفته شود.

***

از سال 2006 کِلِید 2.2.1 ویروس آنفلوانزای فوق حاد پرندگان H5N1 به شکل وسیعی در مصر در گردش بوده و خسارت‌های اقتصادی قابل توجهی در پی داشته است. دامپزشکی مصر [به عنوان مرجع و متولی پیشگیری و کنترل بیماری] با وجود به‌کارگیری یک برنامه فشرده مبارزه به منظور کنترل انتشار ویروس شامل شناسایی ایمنی زیستی و معیارهای امنیت زیستی در مزارع طیور، افزایش اطلاع عمومی از طریق رسانه‌ها، کشتار طیور آلوده، محدودیت جابه‌جایی طیور بین استان‌ها و اجرای واکسیناسیون اضطراری، موفقیت چندانی کسب نکرد و ویروس H5N1 بومی شده و به 3 ساب کِلِید (2.2.1.1,2.2.1.1a,2.2.1.2) که از نظر ژنتیکی متفاوت بودند، تکامل یافت.

حداقل 24 واکسن آنفلوانزای پرندگان H5 به منظور پیشگیری از H5N1 برای استفاده در طیور مصر مجوز گرفتند که سویه‌های بذر واکسن این محصولات تجاری براساس ویروس‌های H5Nx تحت حاد کلاسیک یا H5N1 که ژن‌های 2 گلیکوپروتئین سطحی آن بازآرایی شده، ویروس‌های H5N1(clade 0, 1, 2.2.1, 2.3.2, 2.3.4) در زمینه سویه A/Puerto Rico/8/1934(H5N1) است، بود. برخی از واکسن‌های آزمایش شده ایمنی‌زا بوده و جوجه‌ها را در چالش با ویروس‌های H5N1 فوق حاد پرندگان مصر در شرایط آزمایشگاهی محافظت کردند، اما واکسن‌های H5N1 و H5N2 که به صورت آزمایشگاهی تهیه شده بود، زمانی که در مزرعه آزمایش شد، موفق نبود. مطالعات پیشین روی واکنش‌های متقاطع واکسن‌های تجاری H5 طیور در مقابل جدایه‌های H5N1 مصری در مزارع نشان داد که فقط یک واکسن مبتنی بر ویروس واکسن H5N1 مصری، تیترهای آنتی‌بادی با واکنش‌های متقاطع بالایی تولید کرده است.

ویروس نوظهور آنفلوانزای فوق حاد پرندگانH5N8 کِلِید .2.3.4.4 اولین‌بار در بازار عرضه پرندگان زنده در سال 2010 در چین شناسایی شد. در سال 2014 ویروس‌های H5N8 باعث طغیان‌های متفاوت در طیور اهلی و پرندگان وحشی در کره جنوبی شد. همچنین چند طغیان در پرندگان وحشی یا اهلی در کشورهای اوراسیا و آمریکای شمالی بین سال‌های 2014 و 2017 ثبت شد.

درخصوص اثربخشی و واکنش‌های متقاطع واکسن‌های تجاری در مقابل ویروس فوق حاد آنفلوانزای پرندگان H5N8 دانش کمی وجود دارد. در این مطالعه، اثربخشی 8 واکسن تجاری از سوش‌های مختلف ویروس‌های آنفلوانزا H5 در مقابل ویروس نوظهور آنفلوانزای فوق حاد پرندگان H5N8 در مصر بررسی شده است.

نتایج تحقیقات

8 نوع از معمول‌ترین واکسن‌های ویروس آنفلوانزای پرندگان تجاری و یک واکسن غیرفعال تجربی از ویروس آنفلوانزای پرندگان تحت حاد H5N8 مصری به منظور واکسیناسیون 9 گروه جوجه مورد استفاده قرار گرفتند. همه نمونه‌های سواب اخذ شده از جوجه‌ها تا سن 6 هفتگی از نظر RT-PCR منفی بودند که بیانگر آن است که جوجه‌ها طی دوره پاسخ ایمنی در معرض آلودگی طبیعی ویروس آنفلوانزای پرندگان قرار نگرفته‌اند. به طور نسبی پادتن‌های مادری در هفته اول سن با ویروس‌های H5N1,H5N8 و H9N2 با میانگین تیتر log₂ 4.5, 1.7, 3 واکنش متقاطع داده شدند. در دو هفتگی (سن واکسیناسیون) به طور نسبی میانگین تیتر واکنش‌پذیری در مقابل H5N1,H5N8 و H9N2 ، log₂ 4,3,3 بود. پاسخ‌های سرولوژیکی به انواع مختلف واکسن‌ها به صورت هفتگی تا 4 هفته پس از واکسیناسیون مورد ارزیابی قرار گرفتند (wpv).

جوجه‌های واکسینه با واکسن تجربی تیتر‌های آنتی بادی به مراتب واکنش قابل توجهی در مقابل ویروس همسان در 2 هفته پس از واکسیناسیون با میانگین تیتر log₂ 5.8 نسبت به تیتر گروه کنترل داشتند (نمودار (1). p<0.01) میانگین تیترHI جوجه‌های واکسینه با واکسن تجربی به طور قابل توجهی در 3 هفته پس از واکسیناسیون به 9.1 log₂ افزایش پیدا کرد و به 9.5 log₂ در 4 هفته پس از واکسیناسیون رسید (p<0.001 در مقایسه با گروه کنترل).

هیچ واکسن تجاری آزمایش شده تیتر HI (p>0.05) واکنش قابل توجهی در مقابل ویروس غیرهمسان H5N8 تا 3 هفته پس از واکسیناسیون ایجاد نکرد. در 4 هفته پس از واکسیناسیون، تنها Egyflu یک واکنش متقاطع قابل توجه تیتر HI  6.4 log₂ (p≤0.001) داشت در حالی که سایر واکسن‌ها تیتر HI واکنش قابل توجهی نداشتند (نمودار (1). p>0.05).

- جوجه‌ها در 2 هفتگی واکسینه شده اند.

- داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف استاندارد ارائه شده اند.

نمودار (1): مشخصات لگاریتمی HI پاسخ‌های آنتی‌بادی جوجه‌های واکسینه با 8 واکسن تجاری H5 و واکسن تجربی RG H5N8 در مقابل ویروس H5N8 در حال گردش در مصر

ویروس آنفلوانزای فوق حاد پرندگان A/duck/Egypt/f13666A/2017(H5N8) جدا شده از طیور اهلی برای جوجه‌های غیرواکسینه کشنده بود. این ویروس 100 در 100 تلفات همراه با علائم بالینی عفونت ویروس آنفلوانزای پرندگان شامل تاج و ریش سیانوزه، خونریزی در ساق پا، بی حالی، بی اشتهایی و اسهال در 4 روز پس از عفونت را نشان داد.

تمام جوجه‌های واکسینه با Re-Merial , Zoetis H5N3 و واکسن‌های تجربیH5N8 تا 10 روز پس از عفونت بدون هرگونه علائم عفونت آنفلوانزای پرندگان زنده ماندند (نمودار (2)). در مقابل، جوجه‌های واکسینه با واکسن‌های تجاری در مقابل عفونت ویروسی با میزان تلفاتی در دامنه 60 درصد برای واکسن‌های Nobilis, ME Flu VAC , SER-VAC تا 80 درصد برای واکسن‌های CEVac Flukem, Egyflu, Volvav(B.E.S.T با علائم بالینی ملایم‌تر عفونت آنفلوانزای پرندگان نسبت به جوجه‌های غیر واکسینه تسلیم شدند. با این وجود، این گروه‌ها نرخ بقای بالاتری را نسبت به نرخ زنده ماندن گروه جوجه‌های غیرواکسینه نشان دادند (p<0.01).

نمودار (2): منحنی‌های حیاتی طیور ایمن‌شده و غیرایمن با واکسن‌های آزمایش شده بعد از چالش با 0.5mL of 10^7˙5 EID50 ویروس فوق حاد آنفلوانزای پرندگان H5N8

دفع ویروس به وسیله تعیین تیتر ویروسی سواب‌های حلقی-دهانی و کلواک اخذ شده در روز‌های 2، 4 و 7 پس از عفونت پایش شد. تیترهای ویروسی سواب‌های حلقی-دهانی نسبت به سواب‌های کلواک بالاتر بودند. دفع ویروس در روز چهارم پس از عفونت به حداکثر مقدار خود می‌رسید. در جوجه‌های غیر واکسینه، ویروس هم در سواب‌های حلقی-دهانی و هم در سواب‌های کلواک در روز دوم پس از عفونت با میانگین تیتر  5.3و 5 EID50/mL log₁₀ به طور نسبی شناسایی شد. ویروس از 3 جوجه زنده از گروه شاهد در روز 4 پس از عفونت با تیتر ویروسی مشابه از 5.66 EID50/mL log₁₀ در سواب‌های کلواک و حلقی-دهانی جدا شد. تمام واکسن‌های تجاری، دفع ویروس در جوجه‌های مورد چالش را کاهش می‌دهند. هیچ ویروسی از سواب‌های کلواک و حلقی، دهانی اخذ شده از جوجه‌های واکسینه با واکسن تجربی در روزهای 2 و 7 پس از عفونت یافت نشد. ویروس فقط از یک سواب دهانی در روز 4 پس از عفونت با یک تیتر 2.5 EID50/mL log₁₀ یافت شد.

هیچ ویروسی در سواب‌های کلواک جوجه‌های واکسینه با واکسن RE-5 Merial شناسایی نشد. با این حال از سواب‌های حلقی-دهانی در روز‌های 2 و 4 با تیترهایی از 1.5 تا 2.5 EID50/mL log₁₀ به طور نسبی شناسایی شد. سایر واکسن‌های تجاری، Zoetis H5N3 محافظت در برابر تلفات/ ابتلاء برای جوجه‌های واکسینه فراهم می‌کنند، اما دفع ویروس در سواب‌های حلقی-دهانی در روز‌های 4، 2 و 7 پس از عفونت با تیتر ویروسی 3، 1.3 و 0.5 EID50/mL log₁₀ به طور نسبی مشاهده شد.

دفع حلقی-دهانی در روز 4 پس از عفونت در جوجه‌های واکسینه با Egyflu (5/5 جوجه)، CEVac Flukem (3/5 جوجه)، ME Flu VAC (4/5 جوجه)، (Volvav(B.E.S.T (4/4 جوجه) و SER-VAC (4/5 جوجه) با تیتر ویروسی 3.6 ، 1 ، 2.2 ، 4.6 ، 4.9 و 3.6 EID50/mL log₁₀  به طور نسبی شناسایی شد. ویروس از سواب‌های کلواک جوجه‌های واکسینه در روز 4 پس از عفونت با واکسن Egyflu (3/5 جوجه)،  CEVac Flukem (3/5 جوجه)، ME Flu VAC (4/5 جوجه)، (Volvav(B.E.S.T (4/4 جوجه)، Nobilis (3/4 جوجه) و SER-VAC (4/5 جوجه) با تیتر‌های ویروسی 1.3، 2.7، 2.3، 1، 3.6  EID50/mL log₁₀  به طور نسبی شناسایی شد.

- 5 جوجه از هر گروه به صورت انفرادی با ویروس فوق حاد H5N8 آلوده می‌شدند.

- دفع ویروس به وسیله تیتراسیون log₁₀ EID/mL برای هر نمونه اخذ شده از حیوانات زنده پایش شد.

- هر نقطه تیتر ویروسی از هر جوجه را نشان می‌دهد.

- خط هر واکسن میانگین دفع ویروسی در گروه است.

- محدوده تشخیص 1log₁₀ EID₅₀ /0.1 mL > بود.

نمودار (3): تیتراسیون دفع ویروسی از سواب‌های حلقی، دهانی و کلواک بعد از چالش جوجه‌های ایمن شده و ایمن نشده با جدایه H5N8 آنفلوانزای فوق حاد پرندگان مصری در روز 2 ، 4 و 7 پس از چالش

بحث و جمع‌بندی

عوامل متعددی روی اثربخشی واکسن‌های طیور موثر هستند؛ یکی از این عوامل حیاتی، ژنتیک و مطابقت آنتی‌ژنتیکی بین ویروس‌های در گردش و سویه‌های واکسن تجاری است. براساس کتابچه ارزیابی واکسن سازمان جهانی بهداشت دام (OIE)، یک واکسن موثر باید حداقل 80 درصد جوجه‌های واکسینه را از مرگ محافظت کند و دفع ویروس را بعد از چالش با عفونت کاهش دهد.

واکسن‌های غیرفعال آنفلوانزای پرندگان H5 براساس تمایز فیلوژنتیکی بذر سویه‌ها در مصر از سال 2006 مورداستفاده قرار گرفته‌اند. چند مطالعه تجربی روی جوجه‌ها به منظور ارزیابی اثربخشی انواع مختلف واکسن‌های تجاری در برابر چالش با ویروس‌های H5N1 مصری مختلف از کِلِیدهای 2.2.1، 2.2.1.1، 2.2.1.1a و 2.2.1.2 انجام گرفته است. نتایج سرولوژیکی نشان داده که انواع مختلف واکسن‌های تجاری آنفلوانزای پرندگان واکنش‌پذیری متنوعی را در مقابل آنتی‌ژن‌های توصیف شده قبلی ویروس‌های H5N1 مصری فراهم کرده‌اند (جدایه‌های سال‌های 2006 تا 2009 کِلِید 2.2.1)، اما این واکنش‌پذیری با ویروس‌های در حال گردش جدید کِلِید 2.2.1.3 کاهش پیدا کرده است. بجز واکسن‌هایی که بر پایه ویروس H5N1 مصری هستند، انواع مختلف واکسن‌های تجاری مورداستفاده در مصر، محافظت کامل در مقابل کِلِیدهای مختلف ویروس‌های H5N1 مصری را فراهم نکرده‌اند.

با شناسایی ویروس فوق حاد H5N8 در پرندگان وحشی و طیور اهلی مصر، غالب‌ترین راهبرد کنترلی H5N1 در این کشور، واکسیناسیون با استفاده از واکسن‌های تجاری آنفلوانزای پرندگان H5 بود. با این حال، شناسایی کِلِید 2.3.4.4 ویروس‌های H5N8 در طیور طی سال 2017 نیاز به بازخوانی توانایی واکسن تجاری H5 مورد استفاده در مصر به منظور محافظت طیور در مقابل ویروس نوظهور H5N8 را آشکار کرد. از این رو، اثربخشی 8 نوع از معمول‌ترین واکسن‌های تجاری در چالش با (HPAI A/duck/Egypt/F13666A/2017(H5N8)virus (clade 2.3.4.4 در جوجه‌های نژاد لگ هورن سفید آزمایش شد. آنتی بادی‌های مادری به عنوان یکی از عوامل محتمل مؤثر در شکست واکسن در جوجه‌ها پیشتر بررسی شد. به منظور حذف تداخل آنتی بادی‌های مادری با واکسن‌های متفاوت آزمایش شده، جوجه‌ها در سن 2 هفتگی واکسینه شدند. واکسن همسان تجربی H5N8 بهترین محافظت را در برابر چالش با کِلِید 2.3.4.4 ویروس ایجاد کرد. سرم جوجه‌های واکسینه با واکسن‌های CEVac Flukem ، Egyflu ، Zoetis H5N3 ، RE-5 Merial و (Volvav(B.E.S.T، کاهش واکنش‌پذیر متقاطع را در برابر ویروس H5N8 در مصر نشان دادند و محافظتی برابر یا بیشتر از 80 درصد ایجاد کردند در حالی که واکسن‌های ME Flu VAC ، Nobilis و SER-VAC محافظت در محدوده مورد توصیه سازمان جهانی بهداشت دام (OIE) فراهم نکردند. واکسن RE-5 Merial (تولید شده بر مبنای ویروس 2.3.4 H5N1 clade) جوجه‌ها را از تلفات و کاهش دفع ویروس محافظت کرد. بیشتر واکسن‌های تجاری، جوجه‌ها را در مقابل تلفات محافظت کردند، اما از دفع ویروس جلوگیری نکردند و یا کاهش نداند. این موضوع بیانگر آن است که ویروس‌های H5N8 در گردش ممکن است از محافظت واکسن فرار کنند.

عدم شباهت ژنتیکی و واکنش‌پذیری ضعیف بین واکسن‌های تجاری H5 مورد استفاده در مصر و ویروس‌های H5N8 در حال گردش اثبات می‌کند که واکسن ممکن است در مزرعه موثر نبوده یا فقط محافظت جزئی ایجاد کند، بنابراین، واکسن می‌تواند منجر به فرار سویه‌های موتانت شود.

مواد و روش‌ها

واکسن‌ها و ویروس‌ها

8 نوع از متدول ترین واکسن‌های تجاری در دسترس طی سال 2017 از مرکز توزیع واکسن‌های طیور مصر خریداری شد (جدول (1)). واکسن‌ها متشکل از چند سویه مجوز گرفته به منظور کنترل ویروس H5N1 در طیور بودند.The Volvac® B.E.S.T. (Baculovirus Expression  SystemTechnology واکسن تجاری دوگانه برای ویروس‌های آنفلوانزای H5 و بیماری نیوکاسل است و بر پایه یک باکولویروس نوترکیب شده در سلول‌های حشرات تولید شده است. HA واکسن (The Volvac® B.E.S.T. (Baculovirus Expression SystemTechnology از ویروس (A/duck/China/E319-2/03(H5N1,clade2.3.2 نشأت گرفته است. هفت واکسن غیرفعال با oil-adjuvant بر پایه بازآرایی مهندسی معکوس ژنتیکی ویروس‌های (RG)AI/H5(clade 1, 2.2.1.1 ,2.2.1.2 ,2.3.4) یا سویه‌های بذر واکسن H5N2 کلاسیک هستند. 

ویروس فوق حاد پرندگان H5N8 A/green Winged teal/Egypt/871/2016(clade 2.3.4.4) به منظور تهیه یک واکسن تجربی مورد استفاده قرار گرفت. سویه واکسن RG تولید شده در تخم مرغ جنین‌دار عاری از عوامل بیماری‌زای مشخص 10 روزه (SPF) با 3 پاساژ در هر 48 ساعت تهیه شده و منجر به مرگ جنین نشده است. 

جدول (1): لیست واکسن‌های تجاری H5 مورد استفاده در ایمن سازی طیور در مقابل H5N8

به منظور تولید واکسن تجربی مایع آلانتوئیک حاوی ویروس (RG H5N8(titer=7log₂ HA/50µL از طریق اضافه کردن 0.1 درصد فرمالین و مخلوط با مونتاناید ISA 70 VG با نسبت توصیه شده توسط تولیدکننده (30antigen/70adjuvant) غیرفعال شد. ویروس‌های آنفلوانزای تحت حاد (A/chicken/Egypt/s10489C/2015(H9N2 و (A/chicken/Egypt/D10552B/2015(H5N1 به عنوان آنتی ژن‌ها به منظور شناسایی آنتی بادی‌های تولیدی در مقابل ویروس‌های H9N2 و H5N1 مورد استفاده قرار گرفتند. ویروس آنفلوانزای فوق حاد پرندگان (A/duck/Egypt/F13666A/2017(H5N8 به منظور آزمایشات تجربی چالش مورد استفاده قرار گرفت.

ایمنی جوجه‌ها و آزمایش‌های سرولوژی

تعداد 100 جوجه یک هفته از نژاد لوهمن سفید به 10 گروه تقسیم شدند (10 جوجه/ گروه) نمونه‌های سرم از 10 جوجه به صورت تصادفی به منظور آزمایش آنتی بادی‌های ناشی از ایمنی مادری H5N1, H9N2,H5N8 در سن 1 و 2 هفته جهت انجام آزمایش ممانعت از هم چسبی خون(HI) با استفاده از گلبول قرمز جوجه اخذ شد. 9 گروه از جوجه‌ها 0.5 سی‌سی به ازای هر جوجه از یک واکسن به شکل تزریق داخل عضلانی در ران در 14 روزگی دریافت کردند. یک گروه به صورت غیرواکسینه به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد. یک‌بار در هفته و برای 3 هفته اول پس از واکسیناسیون، نمونه‌های خون از هر گروه و از 7 جوجه به منظور ارزیابی تیترهای آنتی بادی در برابر ویروس H5N8 از طریق آزمایش HI اخذ شد. جوجه‌ها به صورت روزانه از نظر ابتلا و تلفات پایش می‌شدند. سواب‌های کلواک و دهانی به صورت هفتگی و از هر گروه پس از واکسیناسیون به منظور پایش عفونت ویروس تیپ A آنفلوانزا اخذ می‌شد.

چالش آلودگی و تعیین دفع ویروس

از هر گروه، 5 جوجه به صورت تصادفی برای 4 هفته پس از واکسیناسیون انتخاب می شدند. هر یک از این 5 جوجه از طریق 0.5 سی‌سی حاوی 10₇.₅EID₅₀ HP H5N8 ویروس از راه داخل نای و داخل بینی چالش داده می‌شدند (0.25 سی‌سی/ روش). جوجه‌ها سپس به صورت روزانه از نظر ابتلا و تلفات تا 10 روز پس از عفونت پایش می‌شدند. سواب‌های کلواک و حلقی-دهانی از هر پرنده در روز‌های 2، 4 و 7 روز پس از عفونت به منظور تیتراسیون دفع ویروس از هر پرنده در گروه‌های مختلف به وسیله محاسبه EID₅₀ به ازای 1 سی‌سی از ویروس اخذ می‌شد. تمام آزمایشات حیوانی توسط کمیته ملی اخلاق مرکز تحقیقات مصر مورد تایید قرار گرفت. عفونت‌های تجربی در ایزولاتور‌های فشار منفی level 3 ایمنی زیستی انجام گرفت. هر جوجه‌ای که شروع سریع فلجی، بی‌اشتهایی، عدم تعادل و کاهش وزن را نشان می‌داد، معدوم می‌شد.

تحلیل‌های آماری

تحلیل‌های آماری با Graph Pad Prism V5 انجام می‌گرفت. یک آزمایش ANOVA with Turkey’s post hoc به منظور مقایسه تیتر‌های آنتی بادی و میزان دفع ویروس مورد استفاده قرار می‌گرفت. تفاوت‌ها از نظر آماری معنی‌دار بودند (p≤0.05).

تاییدیه اخلاقی

تمام آزمایشات حیوانی با توجه به پیروی از سیاست‌های مرتبط با نگهداری حیوانات مطابق با دستورالعمل‌های بین‌المللی، ملی و یا نهادی برای مراقبت از حیوانات انجام شد و توسط کمیته اخلاقی تحقیق در مرکز تحقیقات ملی تایید شد.